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一. IP、Co-IP、Pull&Down三者的有哪些區別
免疫沉淀（IP）：是指從細胞/組織/血液混合物中富集純化其特異性的靶標或抗原。
免疫共沉淀（Co-IP）：指用抗體用于從混合樣品中富集純化其靶抗原及其結合蛋白。在這種情況下，抗原是誘餌蛋白，而其結合蛋白是通過抗體--抗原相互作用共同純化的相互作用的蛋白。
Co-IP證明兩個蛋白在胞內有相互作用，但是這個作用可以是直接相互作用，也可以是形成復合物后的間接相互作用。
Pull down：類似Co-IP,它是使用誘餌蛋白來“下拉”作為其結合的配體蛋白，pull down與IP或Co-IP的不同之處在于它不是基于抗原-抗體相互作用。在這里，誘餌蛋白是通過標簽而不是抗體固定的。通常在誘餌蛋白上有標簽蛋白，類似包括：6 x His，GST和生物素。結合配體Beads包括：用于所述蛋白質標簽的鎳/鈷，谷胱甘肽和鏈霉親和素等。一般用于體外檢測蛋白質與蛋白質之間相互作用、用于驗證兩個已知蛋白的相互作用，或者篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白。pull-down胞外純化蛋白后證明兩個蛋白之間有相互作用，這個相互作用必然是直接相互作用。
二.我應該選擇磁珠還是凝膠去做免疫沉淀實驗呢？
磁珠比較適合特定蛋白質和蛋白質復合物的常規小規模分離，其在重復性，純度和節省成本上具有很大的優勢。而瓊脂糖凝膠適合純化大量蛋白質或抗體。凝膠的抗體結合能力更高，但是免疫沉淀中的更重要的是抗體的親和性和特異性，而不是磁珠或凝膠的結合能力，并且凝膠在免疫沉淀中的過量結合能力只會助長非特異性結合或珍貴抗體的浪費。所以免疫沉淀實驗一般建議使用磁珠。
與瓊脂糖凝膠不同，磁珠是固體和球形，并且抗體結合于每個珠的表面。盡管磁珠不具有多孔中心來增加結合能力的優勢，但它們粒徑比瓊脂糖凝膠（90μm左右）小得多，這共同為它們提供了足夠的表面積與體積之比，以實現最佳抗體結合。
高功率磁鐵可以將磁珠定位在EP管的側面，并且不影響細胞裂解液的抽吸，而也不會吸取結合在磁珠上的免疫復合物。磁分離避免了離心，離心會破壞弱的抗體-抗原結合并導致靶蛋白損失。
此外，如果使用瓊脂糖凝膠進行免疫沉淀需要用到離心機等設備，但磁珠用于免疫沉淀應用只需要磁力架即可，可以大大降低實驗時間成本，操作更簡潔。
三.磁珠的技術角度特點有哪些？
快速的結合動力學：由于磁珠的數量大約是相同體積瓊脂糖凝膠的1,000倍，因此磁珠擊中目標的可能性要大得多。
孵育時間：由于快速的結合動力學，該孵育通常很短。
背景低：由于快速的結合動力學和較短的孵育時間，背景也非常低。
雜質的捕獲：珠粒沒有內部空間用于雜質的非特異性結合。
抗體消耗量低：磁珠是無孔，均勻的超順磁性，單分散，高度交聯的聚苯乙烯微球，由磁性材料均勻分散在整個磁珠中組成。磁珠上涂有一層薄薄的高度交聯的聚苯乙烯外殼，該外殼包裹磁性材料，并防止磁珠泄漏或配體滯留在磁珠內部。外層還提供了用于吸附或偶聯各種分子（例如抗體）的限定表面積。珠粒大小和形狀的均勻性提供了一致的物理和化學性質。這些統一的物理特性提高了高質量，可重復的結果。
四.直接免疫沉淀和間接免疫沉淀的區別？
直接法：一抗首先與Biolinkedin? Protein A、Protein G或Protein A / G 磁珠結合。然后將磁珠和樣品混合并在2–8°C下孵育。孵育時間取決于靶蛋白的濃度和抗體對該靶蛋白的特異性。當目標蛋白質的濃度很高時，較短的孵育時間應足以捕獲目標。如有需要，可在4°C下延長孵育時間，也可以過夜。
間接法：當抗體對靶蛋白的親和力較弱或靶蛋白的豐度較低時，這是首選方法。首先將一抗與細胞裂解液一起孵育以形成抗體-抗原復合物。然后通過向樣品中添加Biolinkedin? Protein A、Protein G或Protein A / G 磁珠一起孵育，孵育結束后進行磁分離。必須注意避免使用過量的抗體，因為游離抗體結合珠子的速度要比抗體-抗原復合物的結合速度快得多。游離抗體會占據磁珠上的結合位點可能會降低蛋白質產量。
五. IP、Co-IP、Pull down針對裂解液有什么方面的建議？
選用裂解液需要考慮特定的實驗應用，以及靶蛋白在細胞內的位置（細胞核，細胞質或細胞膜等）或則根據樣品類型和靶蛋白需求多種不同的裂解緩沖液。裂解策略的目的是以最大程度地保證結構的完整性。同時注意裂解液中的離子強度（鹽濃度），去污劑的選擇和裂解緩沖液的pH值等，都可能會影響免疫沉淀效率以及靶蛋白的完整性。一些常用的裂解緩沖液包括RIPA緩沖液、NP-40緩沖液等。Biolinkedin品牌可提供專用優化的細胞裂解液，以及相配套蛋白抑制劑、洗脫buffer、中和液、磁力架等。
六．陰性對照組出線目的蛋白條帶？
有時候實驗中會出現以下情況：對照組出現條帶。
一般這種情況并非磁珠質量問題，主要是磁珠與抗體-抗原混合液孵育結束后沒有清洗干凈，導致對照組的非特異性結合。
建議：增加洗滌次數、延長洗滌時間等
七．免疫沉淀實驗中如何避免重輕鏈干擾？解決方案有哪些？
重輕鏈產生的原因一：
免疫沉淀是指從細胞/組織/血液混合物中富集純化其特異性的靶標或抗原。抗體與細胞裂解液中的靶蛋白結合后，與Protein A/G磁珠孵育結合，形成磁珠-Protein A/G-抗體-目的蛋白復合體，經過洗滌后，用電泳上樣緩沖液，煮沸5-10min, 在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，磁性分離后，上清包含抗體、目的蛋白或少量雜蛋白。
進行WB檢測環節中，當使用Anti-lgG(H+L)酶標二抗時，通常會出現免疫沉淀一抗變性后的重鏈（50KDa）和輕鏈（25KDa）兩條帶（可能輕鏈出現頻率不高）。如果檢測目的蛋白分子量在此附近時，會受到這兩條帶的干擾。
解決方案：
方法一：選擇WB一抗時，選擇和IP用一抗不同的種屬，避免IP一抗的干擾
方法二：選擇只和重鏈或輕鏈反應的二抗。
重輕鏈產生的原因二：
當使用Biolinkedin?標簽抗體系列磁珠（如Anti-Flag磁珠），細胞裂解液中的靶蛋白結合后，與Anti-Flag磁珠孵育結合，形成磁珠-Anti-Flag抗體-帶Flag標簽的目的蛋白復合體，經過洗滌后，用電泳上樣緩沖液，煮沸5-10min, 在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，磁性分離后，上清包含抗體、目的蛋白或少量雜蛋白。
進行WB檢測環節中，當使用Anti-lgG(H+L)酶標二抗時，通常會出現免疫沉淀一抗變性后的重鏈（50KDa）和輕鏈（25KDa）兩條帶（可能輕鏈出現頻率不高）。如果檢測目的蛋白分子量在此附近時，會受到這兩條帶的干擾。
解決方案：
方法一：洗脫方式采用酸性洗脫或3xFlag多肽競爭洗脫方式
方法二：選擇WB一抗時，選擇和IP用一抗不同的種屬，避免IP一抗的干擾
方法三：選擇只和重鏈或輕鏈反應的二抗。
八．經常會遇到高背景或非特異性結合的問題，該如何解決？
我們可以從以上幾個方面分析：
裂解步驟過程：
1. 超聲處理期間樣品過熱：將樣品放在冰上，減少脈沖持續時間，并延長脈沖之間的時間間隔。 避免在超聲處理期間樣品過熱。 這可能會導致熱損傷或目標蛋白質的片段化，或可能損害表位。
2. 蛋白質聚集：如果可能，使用新鮮的細胞。 避免冷凍細胞。 如果需要使用冷凍的材料，請使用冷凍的裂解物（在液氮中速凍并儲存在-80°C的溫度）。通過全速離心30分鐘除去蛋白質聚集體。
3. 細胞裂解過程中的蛋白質降解和/或蛋白水解：將樣品放在冰上，并添加蛋白酶抑制劑。如果和磷酸化蛋白一起使用時，還應添加磷酸酶抑制劑。始終使用新鮮制備的蛋白酶和磷酸酶抑制劑。
4. 樣品成分太復雜：細胞收集后可用預冷的PBS洗一次再加細胞裂解液裂解。或者通過從某個細胞區室（例如細胞核）提取目標蛋白來降低裂解液的復雜性。
結合步驟：
1. 結合緩沖區不兼容：請使用合適的結合緩沖液，比如不含SDS等。 如果需要特定化合物，請優化其濃度
2. 洗滌劑濃度過高：降低孵育緩沖液中洗滌劑的濃度：建議的最終濃度為0.1％（例如NP-40-或Triton-X-100）。
蛋白質與珠子（基質）的非特異性結合
使用前，用洗滌/稀釋緩沖液洗滌磁珠1-2次。
可將孵育步驟縮短至60分鐘。
裂解液中細胞過多/蛋白質過多，導致洗脫液中有許多非特異性蛋白質
減少使用的細胞/裂解液數量。
按照磁珠推薦量（25-50ul/組）。 每個IP反應500μg細胞裂解物。
九．經常會遇到靶蛋白沒有結合或則結合量低的問題，該如何解決？
靶蛋白表達低或沒有：目標蛋白濃度越高，IP產量越高。可以通過蛋白免疫印跡檢查靶蛋白的表達譜。 如果目標蛋白表達水平較低，請減少裂解液的加入量，提高目標蛋白濃度。 注意：這可能會增加非特異性結合。
蛋白質的蛋白水解和變性：在裂解和免疫沉淀過程中添加蛋白酶抑制劑，并將孵育樣品置于冰上或4°C環境下。
細胞裂解不完全或無裂解、靶蛋白質不溶：檢查蛋白質是否可溶于裂解緩沖液。可通過蛋白免疫印跡在離心之前和之后表達量并及時配置相應合適的緩沖液。
結合步驟中的干擾物質
含有二硫蘇糖醇（DTT），2-巰基乙醇或其他還原劑的裂解物可能會損害抗體，應避免使用。
孵化時間太短
延長磁珠與裂解物的孵育時間。
IP過程磁珠沉降
確保在磁珠與裂解液孵育過程中懸于裂解液中，可使用旋轉混勻儀等設備。孵育過程中的磁珠沉淀將導致IP效率低下。
無磁力架時，磁珠可以采用離心方式
推薦4℃、1000rpm、3min，過高轉速或造成磁珠碎裂。
磁珠附著在管壁上
加入去污劑以減少表面張力。或者更換低吸付離心管進行孵育。
難以接近的表位
通過為融合蛋白構建體使用長而靈活的接頭序列，減少磁珠與目標蛋白之間相互作用的空間位阻。
洗滌條件
可以根據自身需要適當提高或者降低洗滌/稀釋緩沖液中的洗滌劑和/或鹽濃度。
可以根據自身需要適當提高或者降低洗滌時間。
可以根據自身需要適當提高或者降低洗滌次數。
十.甘氨酸洗脫蛋白差或沒有蛋白（低pH）
1. 首先洗脫效率取決于實際目標蛋白表達總量，目標蛋白表達總量如果不足，那么磁珠結合目標蛋白表達量會很少，洗脫下來蛋白量自然很低。
2. 確保甘氨酸緩沖液的濃度和pH正確。 通過不斷地上下吸打30-60秒來提高洗脫效率，吹打過程中避免氣泡產生。 重復洗脫步驟。不要忘記在洗脫后立即調節pH！
3. 在加入2xSDS樣品緩沖液中洗脫后煮沸珠子，以確認洗脫效率。 再通過蛋白免疫印跡分析上清液以確認蛋白質的存在。
十一.Co-IP實驗沒有成功，原因有哪些？
不存在相互作用蛋白
Co-IP過程中通過IP:蛋白1拉取蛋白2，如果實驗組相互作用蛋白沒有陽性條帶，那么我們首先通過免疫印跡確定Input中蛋白1和蛋白2均表達且表達量可觀，然后通過免疫印跡確定蛋白1已被成功IP,那么提示我們蛋白1和蛋白2在目前處理環境下不存在相互作用
裂解和結合過程可能造成的
1. 蛋白質-蛋白質相互作用在細胞冷凍過程中被破壞：如果可能，使用新鮮的細胞。避免冷凍細胞。
2. 緩沖液成分或濃度的原因破壞或抑制蛋白質-蛋白質相互作用：細胞裂解是Co-IP中的關鍵步驟，請確保使用合適的裂解緩沖液。 RIPA緩沖液可能會使靶蛋白質變性，并可能破壞蛋白質與蛋白質之間的相互作用。對于可溶性蛋白的Co-IP，請使用非洗滌劑的低鹽裂解緩沖液。這種溫和的裂解緩沖液可能最不可能干擾蛋白質之間的相互作用。對于溶解度較低的蛋白質復合物，在裂解緩沖液中添加非離子型去污劑，例如Nonidet?P40 Substitute或Triton?X-100。通過測試適合蛋白質-蛋白質相互作用的各種去污劑和鹽濃度，嘗試不同的結合條件。
3. 缺少蛋白質與蛋白質相互作用所需的添加劑或配體：如果需要，將添加劑或配體添加到結合緩沖液中，以促進蛋白質與蛋白質的相互作用。
4. 孵化時間過長：縮短孵育時間，某些相互作用/蛋白質復合物只是短暫的或不穩定的。如果要檢測低親和力或瞬態相互作用，則可以添加交聯步驟。
洗滌過程原因
緩沖液成分濃度原因，破壞或抑制蛋白質-蛋白質相互作用
確保使用適當的清洗緩沖液：使用溫和的洗滌緩沖液條件并減少洗滌步驟。洗滌劑，鹽和其他添加劑可能會減少非特異性結合，但也會降低收率。通常需要改進洗滌步驟以確定不破壞蛋白質復合物的嚴格程度。每個蛋白復合物都需要其自己的洗滌緩沖液成分才能成功進行Co-IP，并且無法預測分離蛋白復合物所需的緩沖液成分。從每個洗滌步驟中保存用過的洗滌緩沖液，以跟蹤目標蛋白質及其相互作用伙伴是否通過洗滌而耗盡。
ChIP實驗過程在交聯時間太長，無法再訪問結合表位
確保您的IP試劑在交聯后仍能識別靶蛋白。
樣品過熱
將樣品放在冰上，減少超聲時間，并延長超聲之間的時間間隔。避免交聯過程中溫度太高
多聚甲醛會干擾蛋白質與蛋白質的相互作用
使用不含甲醇的甲醛，以避免過度交聯。
十二.蛋白或抗體磁珠穩定性如何？
我們已經在25或37度下存放一周，與放置于2-8度下的樣品進行測試。測試結果表明，Biolinkedin?磁珠在37度下可以存放一周，效果不受影響，產品穩定性很好。
十三.磁珠可以重復利用嗎？
建議不要重復利用，本身IP/Co-IP實驗使用的磁珠推薦量為25-50ul，體積很少，同時使用重復的磁珠增加非特異。
十四.什么是Biolinkedin? Classic IP/Co-IP Kit?
Biolinkedin? Classic IP/Co-IP Kit一款專門為免疫沉淀（IP）和免疫共沉淀（Co-IP）實驗提供的試劑盒， 試劑盒中提供Protein A/G磁珠、蛋白抑制劑、優化的緩沖液，磁性裝備等將使客戶能夠方便快捷完成IP/Co-IP。
該試劑盒的優點：
1. 自由使用任何抗體
2. 相關緩沖系統充分
3. 輕松優化
4. 重現性
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