一、Flag標簽概述

圖1   立個Flag

我們這里所說的Flag和平時大家說的立個flag可不是同一件事，初學者可別弄錯了。親和標簽指的是對特定生物或化學配基具有高特異性的蛋白或短肽，兼具高親和性、純化條件溫和、純化步驟簡易和適用性廣的優勢。而Flag融合標簽作為其中的佼佼者，是專門為蛋白純化和檢測而設計的親水性短肽，由八個氨基酸組成（Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys），如圖2所示。Flag標簽可位于蛋白質的C端或N端，該系統已廣泛應用于各種細胞類型，包括細菌、酵母和哺乳動物細胞等。而利用相應的Flag標簽抗體可對融合蛋白進行檢測和純化，并且能夠大大提高目的蛋白的純化效率。

圖2   Flag融合標簽的氨基酸序列

1.1 Flag標簽的作用原理

作為一種人工設計的融合標簽，這八個氨基酸殘基并非隨意排列，而是與Flag抗原的作用密切相關。Flag序列的第二個氨基酸是酪氨酸（Tyr），屬于芳香族氨基酸，是抗原-抗體特異性反應的主要因素。位于N端帶負電的天冬氨酸（Asp）可輔助Tyr的抗原性，因為在高極性環境中芳香族氨基酸產生作用的可能性高于在低極性環境中。靠近C端的六個氨基酸（Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys）組成一個親水序列，可能形成高度暴露的三位蛋白質構型，在理論上可使序列達到最大的親水性，也就大大增強了Flag融合標簽的抗原性。

1.2 Flag標簽的優勢

Flag作為標簽蛋白，其融合表達目的蛋白后具有以下優點：

（1）序列短小，只用一條人工合成的寡核苷酸鏈就可以編碼；

（2）結晶條件時Flag融合蛋白的構象與單純目的蛋白的構象幾乎完全相同，通常不會與目的蛋白相互作用并且通常不會影響目的蛋白的性質和功能，這樣就有利用研究人員對融合蛋白進行下游研究；

（3）融合有Flag標簽的目的蛋白，可以直接通過Flag進行親和層析，此層析為非變性純化，可以純化有活性的融合蛋白，并且純化效率高；

（4）抗Flag的抗體可有效識別Flag標簽，這樣就方便通過Western Blot、ELISA等方法對含有Flag的融合蛋白進行檢測、鑒定；

（5）Flag融合標簽含有一個腸激酶切割位點，腸激酶可以識別該短肽C端的五個氨基酸(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)，通過腸激酶處理除去標簽后即可獲得天然的非融合蛋白質。

1.3 Flag標簽的切除

目前切除親和標簽的方法主要有兩種：一種是利用特異性的蛋白酶切除融合標簽；二是在融合蛋白中引入蛋白內含肽(或內蛋白子)。引入特異性蛋白酶切位點：腸激酶（enterokinase）、凝血酶、Xa因子、煙草蝕紋病毒（TEV）、genenaseⅠ和3C等蛋白酶，在融合短肽和目的蛋白質之間都具有切割位點。

（1）腸激酶：腸激酶是切除N端標簽（特別是融合在蛋白N端的Flag標簽）時常用的一種蛋白酶，它可精確識別D-D-D-D-K這5個氨基酸殘基所組成的序列，切除效率主要依賴于賴氨酸（K）后的第一個氨基酸。Flag標簽（DYKDDDDK）內部就含有一個腸激酶切割位點，酶切后可以獲得一種只含4個氨基酸殘基的Flag親和標簽。研究人員已經將編碼牛腸激酶催化位點的cDNA序列克隆出來并且在哺乳動物細胞和大腸桿菌中得到表達。腸激酶具有活性高、適應pH范圍廣的特點，且在多種變性劑和清潔劑濃度下均可進行切割，切割后產物不含多余氨基酸。Hosfield等利用不依賴連接的克隆（ligation independentcloning，LIC）方法，引入一個氨基酸殘基到Flag標簽和目的基因之間，形成-DYKDDDDK-X-R序列（X代表引入的殘基，R代表目的基因），并將鈣調蛋白（calmodulin）基因引入上述序列作為R，以研究殘基X對腸激酶切割效率的影響。實驗結果表明：位于切割位點旁的氨基酸側鏈較長且體積較小時，切割更有效。當X是 Lys、Ala、Leu、Ile、Phe、Glu、Met、Asp和Asn時，具有較好的切割效率，可達80%以上。但當X為Tyr或Pro時會使切割效率下降到70%以下，這是因為其增加了空間位阻。以上表述對于獲得天然蛋白質非常重要。故我們可以用LIC方法，將Flag標簽直接連接到目的基因序列上，表達后再利用Flag標簽對產物進行純化，然后使用腸激酶切割去除Flag標簽，以得到天然蛋白，并對其性質和功能進行研究。

（2）凝血酶：也是一種應用很廣泛的蛋白酶，主要特點是經凝血酶切割后的重組蛋白在切割位點的C端會保留兩個氨基酸殘基。凝血酶可識別兩種類型的氨基酸序列，一是X₄-X₃-P-R[K]-X₁-X₂，另一種是X₂-R[K]-X₁，凝血酶對前一種序列的識別效果較為理想。實驗表明，如果設計5個氨基酸殘基在切割位點和N端標簽之間時，可增加凝血酶的切割活性。

（3）Xa因子：與上述蛋白酶相同，Xa因子也是一種較高效的去除融合標簽的工具酶，可特異性識別I-E[D]-G-R-X₁序列，并將融合標簽從其C末端切除，這種識別在眾多蛋白酶中是唯一的，只不過Xa因子的切割需長時間的孵育且效率不高。

二、抗Flag標簽單克隆抗體概述及應用

2.1 抗Flag標簽單克隆抗體的研究進展

目前共有三種抗Flag標簽單克隆抗體被研制出來并投入使用，分別為M1、M2和M5。這三種抗體在使用上特別是和不同抗原結合時有所差異。M1單抗是最早被應用的，其特點是必須在Ca²⁺的參與下才能和Flag抗原結合，常用于許多N端Flag標簽的重組融合蛋白質的鑒定與純化。氨基酸掃描實驗表明，M1單抗的結合主要是前四個氨基酸，并要求具有自由的N末端氨基。也就是說，如果Flag標簽融合在蛋白質的C端，或者融合蛋白的N端有Flag標簽的前提下還有其他氨基酸殘基，M1抗體就無法發揮作用。

為了解決上述情況，抗Flag M2單克隆抗體隨之出現，它大大擴展了Flag標簽的應用領域。由于M2抗體與抗原的結合不依賴于Ca²⁺，故螯合劑（如EDTA）就無法作用吸附柱上的抗原-抗體復合物。M2抗體的另一個重要優點是允許Flag序列前存在多余氨基酸殘基，可應用于N端Met-Flag和C端Flag融合蛋白質。

與通用型的M2單抗相似，第三種單抗M5的結合也不依賴于Ca²⁺，并且多用于類似N-Met-Flag-C的序列，對此種融合蛋白的親和力非常高。因此，M5單抗是用于檢測在細胞質表達的Flag融合蛋白質的首選抗體。而M2單抗可以結合到以上提到所有類型的N末端Flag融合蛋白上，因此具有通用性。三種抗體的作用特點比較見下表1。

表1   M1、M2和M5單克隆抗體作用特點比較

2.2 抗Flag標簽單克隆抗體的制備與鑒定

（1）Flag標簽完全抗原的制備與鑒定：通過碳化亞胺法將Flag標簽與載體蛋白偶聯上，載體蛋白包括牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OVA）、匙孔血藍蛋白（KLH），制備得到3種免疫抗原，3種載體蛋白合成得到的抗原互為包被抗原。

（2）Flag標簽單克隆抗體雜交瘤細胞株的制備：使用上述的抗原與佐劑進行動物免疫，后續采用間接ELISA方法檢測效價。選擇效價最優的進行雜交瘤細胞株的融合，篩選出陽性克隆并進行擴增，最終得到雜交瘤細胞株。

（3）Flag標簽單克隆抗體的制備與鑒定：按照Golding的方法生產腹水，并采用正辛酸-硫酸銨的方法純化腹水，最終得到純化后的腹水。并對腹水的效價、純度、單抗亞型和亞類、交叉反應及相對親和力進行測定，完成Flag標簽單克隆抗體的制備與鑒定。

所有具體步驟在文獻中都有詳細介紹，這里不一一展示。

圖3   抗體基本結構

2.3 抗Flag標簽單克隆抗體的應用

（1）用于融合蛋白的檢測和純化：雖然許多非親和標簽具有生物學活性，可以用于融合蛋白的檢測，但是這些非親和標簽由于表達環境或檢測條件的限制可能會影響自身的部分生物學活性。因此抗體依然是分析融合蛋白表達的最重要方法。在抗融合標簽的單克隆抗體的參與下，表達產物的蛋白質水平可以方便的通過酶聯免疫吸附實驗（ELISA）、免疫印跡等方法進行檢測。這對未知蛋白的表達更加具有意義。除了用于融合蛋白的檢測，抗融合標簽抗體的另一主要用途是進行相應融合蛋白的純化。研究表明，利用抗融合標簽抗體進行免疫親和層析的純化效率非常高，僅此一步就可以獲得10³∽10⁴倍的純化效果。但必須以抗體和目的蛋白的特異性結合為前提。在純化過程中，由于單抗與相應抗原之間具有了特異性結合部位，因而洗脫時只需破壞單一類型的相互作用就能釋放目的蛋白。這樣就能更大程度的保護目的蛋白，并且用于純化的單抗可反復利用。

圖4   抗Flag標簽單克隆抗體在蛋白純化的應用

（2）用于探索蛋白質的結構和功能：人們在所研究的目的蛋白分子的不同部位插入標簽，就可以利用抗標簽抗體對其分子結構進行研究。抗標簽抗體還可以用來研究蛋白質分子的功能特別是是用來研究膜受體的功能。不同配體與膜受體結合后，一般首先通過交聯作用引起受體的聚集，即受體發生二聚或多聚化，然后多聚化的受體再向胞內傳遞信號。這種聚集作用往往是受體啟動信號轉導的必要條件，對某些受體還可能是充分條件。因此，在實驗中可以利用抗標簽蛋白抗體的交聯活化受體，代替天然配體來研究受體的信號轉導或功能。另外，將標簽插入信號轉導分子的特定結構域還可以用來研究分子的信號轉導途徑。

（3）其他：抗標簽抗體還可以作為錨定蛋白將帶有標簽的融合蛋白固定到載體上。與其它固相化方法相比，抗體固定更能夠保持融合蛋白的生物學活性和穩定性，因此在酶學、藥物篩選等方面有廣闊的應用前景。

（4）用于尋找相互作用的蛋白質：研究表明，大部分親和標簽在應用時都不會影響目的蛋白的空間構象和生物學功能。因此，抗標簽的抗體在熒光標記后可以用于尋找與融合蛋白相互作用的蛋白質（包括目的蛋白的配體或受體）。

免疫沉淀技術是利用標簽抗體尋找相互作用蛋白的另一種重要方法。與帶有標簽的目的蛋白相互作用的蛋白質可利用抗相應標簽的抗體沉淀，并通過進一步的分離、純化與鑒定，即可的到與目的蛋白相互作用的蛋白質的信息。免疫沉淀可以直接利用細胞的裂解液進行，也可以通過篩選cDNA文庫進行。針對于目前常用的免疫沉淀技術，我司Biolinkedinò開發了一系列相應產品，有整套的免疫沉淀系列磁珠，其中就包括Flag標簽的磁珠和凝膠產品，如下表2所示。

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