免疫沉淀（IP）技術綜述

一、原理及概述

免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是利用固定在磁珠或瓊脂糖樹脂等固相支持物上的特異性抗體對抗原進行小型親和純化的方法。需要從細胞或組織裂解物中分離用于免疫印跡檢測或其他檢測技術的蛋白和其他生物分子時，免疫沉淀是最常用的方法之一。

免疫沉淀（IP）是利用抗原抗體特異性反應，從特定混合物中（通常是細胞裂解液或表達上清）中純化富集目的蛋白的一種方法。傳統的IP實驗是抗體與目的蛋白結合后，再與蛋白Protein A /G(結合抗體Fc片段)偶聯的瓊脂糖或磁珠孵育，通過離心得到珠子-蛋白A/G-抗體-目的蛋白復合物，復合物經過洗滌、洗脫后用于后續下游實驗。IP是許多蛋白質相關研究的重要步驟，用于研究蛋白質的存在、相對豐度、蛋白表達的上下調、蛋白至穩定性及相互作用等。

二、用于免疫沉淀的磁珠和瓊脂糖樹脂

由于IP技術是作為柱式親和色譜層析的改進方法而開發的，其最初在微量離心管中使用少量（10–25 μL）瓊脂糖樹脂完成。瓊脂糖是不同形狀和大小（直徑50-150 μm）的海綿樣結構。必須通過離心從樣品和緩沖液中分離樹脂：可以沉淀透明樹脂并小心移除溶液，或者使用微量離心過濾管保留樹脂并收集離心后管中的溶液。這些限制了瓊脂糖IP的可擴展化或自動化程度。

磁性微粒（如Bio-Linkedin磁珠）已經大幅取代瓊脂糖，成為免疫沉淀和其他微量親和純化方法的首選支持物。磁性微粒是球形固體，抗體結合僅限于每個磁珠的表面。雖然磁珠不具有多孔中心以增加結合能力的優勢，但它們明顯小于瓊脂糖微珠（直徑0.2-4 μm），可提供足夠大的總表面積以滿足高容量的抗體結合。

強力磁力架可將磁珠定位到孵育管的側壁，使其不阻礙細胞裂解物抽吸，避免吸出與磁珠結合的免疫復合物。磁性分離無需離心，從而不會產生離心導致的抗體-抗原結合破壞和目標蛋白損失。這使得從磁珠中手動移液更簡單，并且可使用儀器全自動完成磁珠操作程序——甚至可用于96孔微孔板。

三、免疫沉淀磁珠的優勢詳解

3.1結合能力和得率

由于瓊脂糖樹脂是多孔（海綿狀）的，其具有較大的表面積-體積比，對抗體的結合能力較高。磁珠的外表面光滑無孔。雖然磁珠直徑遠遠小于瓊脂糖珠（這有利于提高總表面積），磁珠的理論結合能力要比瓊脂糖低。但是，固定在海綿狀瓊脂糖上的抗體并不總能夠與樣品中的目標蛋白（通常為大蛋白復合物）結合，并且抗體可能會在洗滌步驟（離心）中流失。相反，結合在磁珠表面的抗體均能與抗原結合，并且抗體很少會在溫和的洗滌步驟（磁體）中丟失。因此，盡管磁珠的抗體結合能力低于瓊脂糖，但最終的抗原得率通常與瓊脂糖相等或比瓊脂糖更高。

3.2可重復性和純度

使用瓊脂糖時，難以在不破壞和靠近一些沉淀樹脂的前提下完全移除緩沖液。使用磁珠和磁體時，所有磁珠固定在管壁，所以無需碰觸磁珠沉淀即可移除緩沖液。此外，瓊脂糖通常需要較長的孵育時間（使溶液向內部空間的擴散）和預純化步驟（控制非目標蛋白的非特異性結合）。由于所有的相互作用均發生在磁珠的外表面，并且磁珠的尺寸更均一，所以磁珠的可重復性和純度通常高于瓊脂糖。磁珠一般不需要預純化步驟。

3.3簡單、快速和自動化

瓊脂糖和磁珠之間的上述差異正是目前免疫沉淀優先選擇磁珠的原因。由于瓊脂糖免疫沉淀需要較長的孵育時間、預純化步驟和多次離心，所以其需要大量手動操作，總時間為1-1.5小時。相反，一次磁珠免疫沉淀使用只需大約30分鐘即可完成。此外，由于磁性分離不需要離心，在處理多個樣品時更簡單、更快速，更適合自動化。

3.4免疫沉淀磁珠選擇總結

使用磁珠進行免疫沉淀（即，當樣品體積< 2 mL）。在日常小型分離特定蛋白質和蛋白復合物時，磁珠可實現結合能力/得率、可重復性、純度和成本節約之間的平衡。當進行手動和自動化標準IP、Co-IP、ChIP、ChIP-Seq、RIP和pull-down反應并立即用于后續檢測分析時，磁珠是最佳選擇。

四、實驗方法

更多磁珠詳情，請查閱：bejbz.com.cn （Bio-linkedin，翎因生物）