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蛋白水解靶向嵌合體（PROTAC）技術研究進展及降解劑匯總395
來源：醫藥速覽網址： 1. PROTAC概念介紹 蛋??解靶向嵌合體 (PROTAC) 已成為?種全新的藥物發現模式，具有改變傳統藥物發現的潛?，并有可能成為新的重磅炸彈療法。PROTAC 是雙功能分?，由靶蛋?的配體、E3 連接酶的配體和連接linker組成，其目的不是抑制靶標而是誘導靶蛋白通過蛋?酶體系統被降解。
PROTACs 于 2001 年?次被報道用于作為??靶向泛素連接酶復合物 Skp1-Cullin-F 【1】。泛素蛋?酶體系統(UPS)和?噬/溶酶體途徑是細胞內蛋?質降解和維持體內蛋白穩態的主要途徑。 PROTAC 是?種雙功能分?，可依賴泛素-蛋?酶體系統 (UPS)，以實現疾病相關靶蛋?的降解。蛋?質泛素化是?種 ATP 依賴的酶促反應，包括三個步驟和三種酶：泛素激活酶（E1 酶）、泛素結合酶（E2 酶）和泛素連接酶（E3 酶）。?先，泛素被 E1酶以 ATP 依賴性?式激活，然后活化的泛素被轉移到 E2 酶，最后E3連接酶催化泛素從E2上以共價鍵方式轉移到底物上。泛素是具有76個氨基酸的高度保守的肽段，包括7個賴氨酸殘基和一個N端，每個賴氨酸都可以被泛素化，從而導致底物有單泛素化、多泛素化和多聚泛素化等情況，其中多聚泛素標記的蛋?可以被 26S 蛋?酶體識別并降解【2】。
圖1 泛素蛋白酶體系降解蛋白圖解 2. 作用機制及優點 PROTACs 可以使自然情況下沒有相互作?的兩種蛋?質靠近，從而實現?為誘導的靶標降解。因此，PROTAC小分子的成功主要依賴于其結構中雙分子對E3 連接酶和 POI 的高親和?，與傳統藥物相?，降解 POI 不需要有任何功能活性。 PROTAC 的作??式正在顯著改變“可成藥”的方式。傳統意義上能否成藥通常取決于是否可以設計可以結合空腔或?袋的?分?來抑制其活性，從?產?治療效果。然而迄今為?，已知數以千計的蛋?蛋白相互作? (PPI)沒有深?袋，也沒有明確定義的結合位點和只有平坦的蛋?界?，因此使用傳統小分子研究PPI具有極高難度，因此PROTAC適?于靶向缺乏活性結合位點的轉錄因?或膜結合蛋?，此外PROTACs 的持久?物學效應與經典的受體依賴性藥物相?具有顯著優勢(圖2)。 盡管PROTAC分子具有相對較?的分?量，但它們可以維持?夠的細胞內濃度，結合催化作?機制，成功地導致蛋?質降解。雖然細胞攝取的確切機制尚不完全清楚，但不同的 PROTACs在不同的細胞類型中均顯?出細胞滲透是?被動過程【3】。  LYTAC和AbTACs概念介紹 3. 降解劑類型 在蛋?酶體介導的蛋?質降解過程中，E3 連接酶是關鍵成分，目前已知有 600 多種 E3 連接酶，但迄今為?只有少數?種被?于 PROTAC。根據所使?的E3連接酶對PROTACs進?分類，最常?的有cereblon、Von Hippel Lindau (VHL)、 MDM2、cIAP1和其他降解劑（圖3）。  圖3 常用E3連接酶配體的結構 3.1 基于 Cereblon (CRBN) 的降解劑 沙利度胺及其衍?物來那度胺被定性為免疫調節藥物（IMiDs），并已獲得多發性?髓瘤的批準。從機制上講，IMiD 靶向 E3 泛素連接酶 CUL4-RBX1-DDB1-CRBN【4】，IMiD 與 cereblon 的結合允許募集 IKAROS 家族（IKZF1 和 IKZF3）的轉錄因?并使得其內源性底物泛素化【4】。2014年，沙利度胺結合的DDB1-CRBN配合物的晶體結構被解析后，基于 CRBN 的降解劑逐漸被開發，包括溴結構域和末端外 (BET) 蛋? (BRD2/3/4)，FKBP12，BCR-ABL，BRD9，Sirt2，CDK9，FLT3，BTK, CDK4/CDK6等。 3.2 基于 Von Hippel-Lindau (VHL) 的降解劑 關于 VHL相關的PROTAC分子，最初是由HIF1-α 衍?肽段被替換為帶有羥脯氨酸部分的?分?, 從?得到的 VHL ?親和?和?特異性結合劑。基于?分?的 VHL-PROTAC 的例?已經可以有效降解多個蛋白：HaloTag 融合蛋?，致癌 BCR-ABL，BRD4，TBK1，?種酪氨酸激酶（EGFR、HER2 和 c-Met）和 TRIM24 等。  《Protein degradation: Prime time for PROTACs.》3.3 基于 MDM2 的降解劑 盡管與CRBN 和 VHL 相?，基于MDM2 的降解劑的研究相對較少，但仍然具有非常重要的科學意義。Nutlins 是與 MDM2 的 p53 結合?袋結合的配體，可以用來?合成破壞 MDM2 與轉錄因? p53 的相互作?，?不影響 MDM2 的 E3 連接酶活性的PROTACs,2008,Crews等人合成了帶有Nutlins片段的PROTAC分子，可以作為MDM2和SARM的配體,該分子可以成功進入細胞并將SARM募集到MDM2附近并被降解。 此外，他們設計合成了?種招募 MDM2 的 BRD4 降解 PROTAC-A1874，它由MDM2 配體- idasanutlin和 BRD4/BET 抑制劑- JQ1組成，值得注意的是，這是?次報道 E3 連接酶配體和靶向彈頭產?的協同抗增殖作?，因為A1874能夠降解 BRD4 并同時穩定 p53。 3.4 基于cIAP1 的降解劑 2010年,Hashimoto課題組公開了由甲基 bestatin (MeBS) 組成的全新 PROTAC的結構，它可以選擇性結合 cIAP1 的 BIR3 結構域，其 RING 結構域可以促進?泛素化。基于 cIAP1的PROTAC 可以成功地誘導靶蛋? CRABP-1 和 CRABP-2 的降解。
圖4 基于cIAP1降解劑的結構優化 3.5 其他降解劑 發現新的降解誘導抑制劑對于擴展PROTACs的結構至關重要，2012年，Hedstrom 等?表明叔-氨基甲酸丁酯保護精氨酸（Boc3Arg) 部分可以誘導與其連接的配體的降解，并且該過程不依賴于 ATP 和泛素【6】，其機制為Boc3Arg 連接的配體將靶蛋?定位到 20S 蛋?酶體，從?誘導降解。 4. 結構分析  圖5化合物及蛋白共晶結構（左 Dbet1 右JQ1） PROTAC發揮作用的關鍵步驟是形成?親和?、持久的 E3 連接酶- PROTAC – POI三元復合物。?分辨率結構表明 PROTAC 分子dBET1與 BRD4 結合，且結合模式余抑制劑 JQ1相似 (PDB 4ZC9)（圖5），此外2017 年，Ciulli 等?解析了第一個分辨率為 2.7? 的三元配合物晶體結構 (PDB 5T35)。 PROTAC 分? MZ1 由BET溴結構域抑制劑 JQ1 與高效且特異性強的 VHL 配體 VH032 (4) 和PEG linker組成。MZ1 與 Brd4 的第?個溴結構域 (Brd4BD2) 和 pVHL:ElonginC:ElonginB 存在?泛的疏?相互作用和干擾了蛋?-蛋?相互作?，VH032占據了VHL中脯氨酸的結合空腔，PEG linker與蛋白存在范德華作用力和氫鍵，此外，JQ1 和 VH032 配體的溶劑暴露區域埋在界?中，因為這兩個蛋白質在空間上?常接近（圖6）。總之共晶結構的發展為設計高親和力，特異性強的PROTAC分子提供了可能。 計算機輔助設計已應?于 PROTAC 設計，以合理設計和優化雙功能分?的結構。Drummond 和 Williams 最近的?作提供了較為清晰的總結【7】。
5. 三元復合物和動?學 PROTAC與抑制劑的區別之一在于PROTAC需要形成三元復合物，關于三元配合物的形成和隨后的有效降解存在三種不同的可能性。發?有效降解的第?種可能性是形成穩定的三元復合物，這需要 POI 和 PROTAC 之間的?親和?，以及與 E3 連接酶有穩定的相互作?。在第?種可能性中，雖然具有某種弱親和?，但具有有利的相互作?，如果三元配合物穩定，降解也可能是有效的。相反，在第三種可能性中，?親和?在沒有有利相互作?的情況下會導致不穩定的三元配合物，因此降解是?效的。因此，PROTAC 適?于“困難”靶標，即已知抑制劑能夠與靶標相互作?，但由于結合較弱，不適合進?步的臨床開發或蛋?-蛋?相互作?，其中沒有明確定義的?袋是?個典型特征。 關于動?學，PROTACs 也不同于經典小分子抑制劑。在多項 PROTAC 研究中，當使??濃度時，經常觀察到“hook effect”。在?濃度的情況下，容易產生非功能性的?元復合物 PROTAC: E3 連接酶和 PROTAC: POI而不是降解所需要的三元復合物。 6. Tau-PROTAC Tauopathies 屬于神經退?性疾病，具有異常形式的 tau 蛋?的特征性積累，導致局灶性?腦區域的神經元死亡，進而造成許多疾病的發生，例如阿爾茨海默病 (AD)，雖然確切的發病機制仍然難以捉摸，但有許多科研人員已經提出了?些猜想，例如β-淀粉樣蛋?級聯反應和致病性 tau 蛋?的形成。 曾有文獻報道由 Tau 識別肽部分、細胞穿透肽和 E3 連接酶識別肽部分組成的多功能分?可以增強細胞中 Tau 的降解，并測試了多功能肽在??神經?細胞瘤 N2a 的細胞系中誘導 Tau 降解的能?。其中化合物 TH006 效果最佳，共聚焦顯微鏡數據顯? TH006 能夠進?細胞，且western blotting和流式細胞術的進?步分析證明它可以有效誘導了細胞內 tau 降解。 此外，20018年有文獻報道了?種通過招募 Keap1-Cul3 泛素 E3 連接酶靶向 Tau 的PROTAC肽【8】，這個多肽在Tau過表達的不同細胞系中均顯?出能夠進入細胞并誘導 Tau 降解，然?，基于肽的 PROTAC 和?分? PROTAC 可能需要進?相當?的結構優化才能通過?腦屏障。
《Discovery of a Keap1-dependent peptide PROTAC to knockdown Tau by ubiquitination-proteasome degradation pathway》7. PROTAC發展史 PROTAC 蛋?質降解劑的概念由Proteinex于 1999首次報道，但后續沒有繼續深究【9】。兩年后，耶魯?學的 Craig Crews發表靶向蛋白降解劑的相關研究文獻，2008 年，Crews 和同事報告了第?個?肽的PROTAC，利用?分?招募 MDM2 作為 E3 連接酶來降解雄激素受體(AR)；2013 年，Crews 成?了Arvinas公司（康涅狄格州紐??），將 PROTAC 技術逐步開發到臨床；2017 年，Arvinas 選擇?于前列腺癌的雄激素受體（AR）PROTAC 和?于乳腺癌的雌激素受體 (ER) PROTAC 作為?批臨床試驗候選者；2021年Arvinas的兩個候選化合物（ARV-471和ARV-110）展開了臨床二期的研究。 8. 總結 PROTACs在很多??都沒有遵循經典的藥物發現規則，例如作?機制，動?學，三元配合物的形成，分子性質偏離Lipinski的五規則。然?，三元復合物的第?個晶體結構的解析以及動?學研究顯著提?了我們對這種新模式的理解，并且PROTAC分子已經為許多具有挑戰性的靶標積累了許多有效的臨床前數據，包括 Tau 蛋?、雄激素和雌激素受體。與其他蛋白降解的技術（例如?于癌癥治療的 CRISPR 和 RNAi）相?，PROTAC 具有與靶標可逆結合的優勢，這種效應不是永久性的，因此與 CRISPR 相?，預期的脫靶效應更少。 PROTACs的一個局限性是它主要針對細胞質或細胞核內蛋白，無法靶向細胞外蛋白，但讓人興奮的是，2019年Crews團隊設計了一種ENDTAC分子，通過利用細胞的內吞作用（endocytosis）實現靶向降解細胞外蛋白。總體??，PROTAC 代表了?種新的藥物發現模式，具有改變傳統藥物發現的潛?。
//doi.org/10.1021/acscentsci.9b00224 參考文獻： 【1】2019. PROTACs– a game changing technology. Expert Opinion on Drug Discovery 14, 1255–1268. 【2】Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proc Natl Acad Sci. USA. 2001;98(15):8554–8559. 【3】Kaiser, P., Huang, L., 2005. None. Genome Biology 6, 233. 【4】Churcher, I., 2018. Protac-Induced Protein Degradation in Drug Discovery: Breaking the Rules or Just Making New Ones? Journal of Medicinal Chemistry 61, 444–452. 【5】2012. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia 26, 2326–2335. 【6】2012. Double protein knockdown of cIAP1 and CRABP-II using a hybrid molecule consisting of ATRA and IAPs antagonist. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 22, 4453–4457. 【7】Chem Biol. 2012 May 25; 19(5): 629–637. 【8】Drummond ML, Williams CI. In silico modeling of PROTAC-mediated ternary complexes: validation and application. J Chem Inf Model.2019;59(4):1634–1644. 【9】Discovery of a Keap1-dependent peptide PROTAC to knockdown Tau by ubiquitination-proteasome degradation pathway .Eur J Med Chem.2018; 146:251–259. 【10】Controlling protein levels in eucaryotic organisms.US6306663B1(1999) 版權申明： 本文內容轉載于醫藥速覽，系出于傳遞更多信息之目的，且明確注明來源和作者，不希望被轉載的的媒體或個人可與我們聯系，我們將立即進行刪除處理。 |
