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IP-MS — 蛋白互相作用研究中的“檢測器5744
蛋白-蛋白相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）介導了許多的生物學過程，其在催化、轉運、信號傳導等許多生命過程中具有重要的意義。鑒定蛋白質與蛋白質之間的相互作用（protein-protein interaction，PPI）是后基因組時代的重要研究內容。
蛋白-蛋白相互作用類型
a：兩個球狀蛋白預先形成一個表面，然后靠近再產生相互作用 b：兩個球狀蛋白在靠近過程中，互相誘導產生表面并產生相互作用 c：一種剛性球狀蛋白與多肽產生相互作用 d：一種柔性球狀蛋白與多肽產生相互作用 e：兩個多肽之間產生相互作用
質譜是蛋白互相作用研究中的蛋白質“檢測器”
一般的質譜技術是不能直接研究蛋白互相作用的，需要和其他技術聯用，比如常見的有免疫共沉淀（CO-IP）和pull down等實驗，然后再用質譜這種蛋白質“檢測器”來告訴我們樣品中存在哪些蛋白，甚至于可以比較不同樣本中，這些蛋白的相對豐度，尋找差異蛋白。質譜這種蛋白質檢測器與傳統的看分子量的SDS-PAGE以及依靠特異性抗體的Western blot（蛋白質印跡法）相比，它不僅能夠驗證已知蛋白相互作用，還可以鑒定與目標蛋白發生相互作用的未知蛋白。所以它的結果還是很有價值的，這也是大家越來越重視它的原因。
免疫沉淀串聯質譜分析（IP-MS）是目前應用最廣泛的蛋白相互作用研究方法的一種。IP-MS的主要原理是基于特異性抗體或其他親和試劑與靶標蛋白的親和作用，通過免疫共沉淀（co-Immunoprecipitation）將靶標蛋白與靶標蛋白的相互作用蛋白從復雜的樣本中提取出來，進而進行質譜檢測以鑒定靶標蛋白的相互作用蛋白。 理想的IP-MS實驗會通過特異性靶向目的蛋白以檢測更接近生理狀態下的蛋白相互作用，但這種檢測準確性很大程度上會受到目的蛋白內源表達水平低或抗體效價低等因素干擾。因此，過表達目的蛋白并帶有融合標簽（例如Flag、HA、Myc等）是一種很好的選擇。
由于IP－MS實操作上與常用的IP-WB的實驗非常相似，但是具體流程需要隨質譜儀器性能的提升和數據分析方法的發展對實驗方法和策略進行調整和優化。
Biolinkedin將分享以下一些IP-MS建議。
一、細胞用量 IP-MS實驗起始細胞用量主要需根據細胞種類、靶標蛋白表達豐度、親和抗體效價等因素進行調整。通常每個樣品起始細胞量建議不少于2x107。如果是靶標蛋白高表達的細胞系，如過表達的標簽蛋白，或是細胞內高表達的內源性蛋白（如Actin、RPS等）可適當降低細胞用量，但建議不少于1x107。在一定范圍內，細胞用量越多，能夠獲得的質譜檢測結果越好。
二、抗體選擇 抗體是決定IP實驗是否成功的最關鍵因素。 有研究統計過數千種商業化抗體的檢測效果，其中能夠在WB實驗中獲得良好結果的不到30%，在WB實驗中明確結果無效的接近50%。通常來說，IP實驗對抗體的要求較WB更高，而為了盡量降低由抗體非特異性導致的假陽性互作鑒定結果，IP-MS中所用的抗體相比傳統IP-WB，也會有更高的要求。 因此，用于IP-MS實驗的抗體，建議經過以下4步進行篩選和驗證：
（1）盡量選擇已標明可用于IP實驗的抗體，尤其是已發表高分文獻中引用的品牌以及貨號。 （2）查詢抗體生產廠商及以前使用者提供的使用結果。 （3）購買抗體后進行IP-WB預實驗，根據結果判斷抗體效果。優先選擇條帶大小與靶標蛋白一致，且無其他非特異性條帶的抗體。 三、Beads
目前常用的基質材料有兩種，一種是瓊脂糖凝膠（Agarose/Sepharose），另一種是磁珠（Magnetic beads）。相比瓊脂糖凝膠，磁珠通常親和效價更高，操作更簡單，清洗效果更好，但成本也稍高。在IP-MS實驗中更建議使用磁珠進行實驗。 Beads中的IgG結合蛋白通常可分為Protein A，Protein G和Protein A/G。針對IP實驗中最常用的鼠抗和兔抗，Protein A和Protein G均能有效結合，但二者針對其他種屬的抗體結合能力略有差異。Protein A/G是同時含有Protein A和Protein G抗體結合結構域的融合蛋白，對絕大部分IP實驗中采用的抗體均能有效結合。 當然，如果是過表達外源性靶蛋白并帶有融合標簽（例如Flag、HA、Myc等） 可以直接使用標簽抗體磁珠，如Biolinkedin?Anti-Flag Magnetic beads ,省去磁珠與抗體偶聯這一步，更加便捷。 PS: Biolinkedin免疫沉淀系列
四、裂解液、清洗液和洗脫液
裂解液通常主要由去垢劑、抑制劑和緩沖體系三部分組成。
IP所用的裂解液中，去垢劑通常為 0.5%-2%的NP40或TritonX-100，也可二者聯合使用。為了提高裂解效率，少數裂解液中也會含有0.01%濃度的SDS或SDC。但需要注意的是，其他裂解液中常用的高濃度SDS（>0.1%）會破壞蛋白與蛋白的相互作用，因此通常不能使用在IP實驗中。
由于IP實驗需要進行孵育，為了避免蛋白降解，裂解液中通常需要加入蛋白酶抑制劑。此外也可根據靶標蛋白類型及具體的研究目的，額外添加磷酸酶抑制劑等。
IP緩沖液中常見的緩沖體系為150 mM NaCl/50 mM Tris-HCl，pH 7.5。不同課題組和研究者所用的鹽濃度和pH值可能略有差異。需要注意的是，高鹽濃度的緩沖體系（＞300 mM NaCl）會很大程度上破壞較弱的蛋白相互作用，導致質譜檢測的蛋白鑒定結果急劇減少。
在常規的IP-WB實驗中，通常可直接以裂解液作為清洗液，以含有高濃度SDS、溴酚藍和β-巰基乙醇的loading buffer作為洗脫液。但在IP-MS實驗中，為了更適配后續的質譜檢測樣品處理，需要清洗之后的樣品中不含有去垢劑成分。因此建議以不含去垢劑的緩沖體系，或在常規清洗液清洗后，以PBS或緩沖體系進行清洗置換。為了盡量保留樣品中的互作蛋白，避免樣品制備過程中的蛋白損失，建議清洗之后直接以beads沉淀進行后續用于質譜檢測的樣品制備，而不進行蛋白的洗脫。
五、設置對照組以及重復實驗
設置對照組的目的就是通過對比對照組結果，能更好的剔除假陽性結果。同時，為了避免單次實驗的偶然誤差，盡可能增重復實驗次數，雖然這樣前期研究成本會上升，但是對于篩選出高可信度的相互作用蛋白尤為重要，并且會大大降低后期蛋白相互作用驗證的工作量。所以整體來看，增加了結果可靠性，其實成本反而是下降的。
Biolinkedin提示具體實驗步驟可參考 操作流程 貼壁細胞樣品： 1. 移去培養基，用 PBS 洗細胞兩次。 2. 收集細胞至1.5 mL EP 管內，按比例加入Biolinkedin?IP Lysis/Wash Buffer，同時加入PMSF等相應的抑制劑，混勻后置于冰上靜置5-20min（期間混勻幾次）。 3. 4 ℃,12000-16000 g,10 min離心收集上清液，置于冰上以備后續實驗（或置于-80 ℃長期保存）。 培養皿IP Lysis/WashBuffer推薦使用體積：
懸浮細胞樣品： 1. 4℃、500-1000 g、10 min，收集細胞，棄上清。 2. 用PBS 洗細胞一次，即用 PBS 將細胞團重懸，4℃、500-1000 g、10 min，收集細胞，棄上清。 3. 用預冷的IP Lysis/Wash Buffer重懸細胞。同時加入PMSF等相應的抑制劑，混勻后冰上靜置5-20 min（期間混勻幾次）。 4. 4 ℃, 12000-16000 g,10 min離心收集上清液，置于冰上以備后續實驗（或置于-80 ℃長期保存）。 免疫復合物的制備 注意：樣品所需的量和孵育時間均依賴于每個特定的抗體-抗原體系，因而可能需要優化才能得到最大產量。 以下實驗方案針對5-15μg 親和純化的抗體，根據需要可以按比例放大。 1. 在離心管中，將每個樣品的細胞裂解液與免疫沉淀抗體結合。 2. 用IP Lysis/Wash Buffer將抗體以及制備好的樣品稀釋至500μL-800μL。 3. 在4 ℃ 孵育2-4h或者過夜，以形成免疫復合物。 免疫沉淀： 注意：為保證磁珠均勻分布，使用前通過反復顛倒或輕微渦旋混勻瓶中磁珠。 1. 將50-200μL的Biolinkedin? Protein A/G Magnetic Beads加入1.5 mL 離心管中。 2. 向磁珠中加入500 -1000μL 預冷PBS，輕柔混勻。 3. 將離心管放入磁力架中收集磁珠到離心管的一邊。去除上清。 4. 向離心管中加入500-1000 μL IP Lysis/Wash Buffer。顛倒離心管數次或輕微渦旋混勻1min。用磁力架收集磁珠。去除上清。 5. 將抗原樣品/抗體混合物加入裝有磁珠的離心管中，保持混勻4 ℃ 孵育4-6h或者過夜。 6. 用磁力架收集磁珠，除去未結合的樣品，保存以備分析。 7. 向離心管中加入800 -1000 μLIP Lysis/WashBuffer，輕柔混勻數次。收集磁珠，棄上清。再重復洗兩次。
質譜送樣準備： (一)溶液蛋白定性：(接步驟7) 8. 將蛋白從磁珠上洗脫下來。 9. 最好測定蛋白濃度后，干冰寄送液氮速凍的蛋白溶液（需指明緩沖液成分和濃度）；或將蛋白通過TCA法或丙酮法沉淀，晾干后，干冰或冰袋寄送。 inhibitor cocktail（50×） | 2 mL |
PMSF（100×） | 1 mL | |
Elution Buffer | 5 mL | |
Neutralization Buffer | 1 mL | |
磁力架 | 雙排16孔 |
六、結果分析
一般在IP-MS實驗中，我們會通過蛋白成分鑒定的方式篩選互作蛋白。通過對比實驗組和對照組結果將實驗組中蛋白篩選為靶標蛋白的互作蛋白。
不過隨著質譜檢測靈敏度的不斷提升，現在極微量的非特異性結合或清洗殘留的背景蛋白也會被檢測到，導致檢測結果信息量急劇增加；而且很多蛋白之間的相互作用是較弱的、瞬時的、動態的結合，簡單的通過蛋白成分鑒定的方式未必能全部檢測出來。
因此在目前的IP-MS數據分析中，主要以蛋白的非標記定量信號強度（LFQ intensity）作為蛋白定量數據，比較實驗組與對照組間蛋白定量差異，與常規定量蛋白質組學數據分析方法類似，只是通常選擇更高的差異蛋白篩選閾值。
因此，在目前的IP-MS實驗中，通常會選擇較為溫和的清洗條件，以保留更多的弱相互作用蛋白以及無法避免的背景蛋白和非特異性結合蛋白，之后基于定量蛋白質組學數據，即質譜檢測獲得的蛋白定量矩陣，通過實驗組與對照組的蛋白定量比較篩選高可信的蛋白相互作用，過濾背景蛋白和非特異性結合。
IP-MS結果中Fold Change和Intensity兩項指標很關鍵。Fold Change表示IP實驗組和對照組間蛋白的定量差異倍數，Intensity表示IP樣品中蛋白的檢測信號，可反映樣品中的蛋白豐度。通常選擇Fold Change和實驗組樣品中Intensity數值較大，排名靠前的蛋白作為后續研究的重點研究蛋白。
但是我們也要注意，結果中蛋白的Fold Change和Intensity通常低于靶蛋白的Fold Change和Intensity。如果結果明顯高于靶蛋白的數值，需要考慮是非特異性結合。
在后期分析中、更需要結合Pubmed、UniProt、STRING等數據來進行全面分析，比如核糖體蛋白（RPS蛋白家族）、細胞骨架蛋白（Actin等），一般需要被忽略。
蛋白質互作網絡（PPI, Protein-Protein Interaction Networks）是由蛋白通過彼此之間的相互作用構成，來參與生物信號傳遞、基因表達調節、能量和物質代謝及細胞周期調控等生命過程的各個環節。系統分析大量蛋白在生物系統中的相互作用關系，對了解生物系統中蛋白質的工作原理，了解疾病等特殊生理狀態下生物信號和能量物質代謝的反應機制，以及了解蛋白之間的功能聯系都有重要意義，常常與篩選關鍵基因相關聯。
目前常用的制作PPI的工具為STRING數據庫（//cn.string-db.org）。STRING數據庫是一個搜索已知蛋白質之間和預測蛋白質之間相互作用的數據庫，該數據庫可應用于2031個物種，包含960萬種蛋白和1380萬中蛋白質之間的相互作用。它除了包含有實驗數據、從PubMed摘要中文本挖掘的結果和綜合其他數據庫數據外，還有利用生物信息學的方法預測的結果。
以下為PPI輸出圖形的結果解讀：
網絡圖（以輸入蛋白為中心）
1.節點(node)
圖中每個節點表示一個蛋白，由同一個基因產生的不同isoform將被合并，在節點上標記的字母為對應基因的gene symbol。
圖中有些節點內部有螺旋狀的結構，這表示該蛋白的三維結構已知，如果未知的話，節點內部為空。
默認情況下節點的顏色分成紅色和白色，紅色代表是你的查詢蛋白，白色代表與查詢蛋白具有相互作用關系的其他蛋白。由于白色不太好看，string會根據與相互作用的score值對顏色進行映射。Score值詳情見下圖：
2.邊（edge）
節點之間的連線表示兩個蛋白之間的相互作用，不同顏色對應不同的相互作用類型，示意如下：
從圖中可以看到，兩個蛋白之間的連線不止一條，這表示兩個蛋白間存在多種相互作用關系。所有的相互關系中，既有實驗驗證的，也有數據預測的結果。
圈圖
除了STRING數據庫的輸出結果，還可以通過Cytoscape等工具加工、美化PPI，其中的一種形式就為圈圖，在圓圈上的每個節點都代表一個蛋白，彼此之間的連線則指示彼此之間的相互作用。有
節點的顏色有時指示介數中心度，在本圖中，具有高介數中心度的節點被標記為紅色，意味著這些蛋白在這個網絡中具有中心地位。
另外，蛋白質修飾位點也可以通過質譜方式加以分析確定。
翻譯后修飾（Post-translational modifications, PTM）目前規模化研究的蛋白修飾主要有磷酸化（Phosphorylation）、乙酰化（Acetylation）、甲基化（Methylation）、糖基化（Glycosylation）、泛素化（Ubiquitination）等。PTM增加了蛋白質組的復雜性，對蛋白質結構，分布和功能產生巨大影響。它在細胞生物學中起重要作用，包括細胞信號傳導，細胞結構，DNA修飾等。同一蛋白在不同生理狀態、不同亞細胞定位、不同氨基酸位點的修飾，可能對應不同的功能。因此蛋白質翻譯后修飾是當前的一個研究熱點和難點。
質譜是一種強大的技術，可用于蛋白質修飾位點的分析。利用質譜技術可以對單一蛋白的修飾位點進行鑒定，也可以進行高通量蛋白質組修飾譜分析。
質譜技術主要是通過測定樣品的質荷比（m/z）進行分析。蛋白質經過修飾后，分子量會增加。這種分子量的增加在蛋白質圖譜中表現為質譜峰發生相應的漂移。例如，肽段磷酸化后，會產生+80Da的質量偏移。質譜通過檢測多肽離子的質量來鑒定肽，從而可以檢測出PTM導致的質量偏移，進而識別發生翻譯后修飾的蛋白。
七、注意事項
PVDF或者NC膜上的蛋白不能進行質譜檢測。
樣本準備Q&A：
Q：用于質譜檢測的蛋白溶液樣品溶劑要求?
A：蛋白溶液 SDS 含量低于 0.1 %
Q：用于質譜檢測的蛋白溶液樣品蛋白量要求?
A：單一蛋白溶液蛋白總量不少于 1 5μg；混合蛋白溶液蛋白總量不少于 50μg（若各成分蛋白含量相差較大，含量較少的蛋白不易被檢測到）
Q：用于質譜檢測的膠條樣品大小要求？
A：膠條以 1 cm*1 cm 為宜，膠條過大容易導致酶解效率低，建議分成多份進行酶解。
Q：用于質譜檢測的膠條樣品染色要求？
A：膠條一般進行銀染或者考染；若檢測全部整個泳道蛋白的，可直接固定無需染色；染色無需顏色過深（脫色反而費時）
Q：用于質譜檢測的膠條樣品切膠要求？
A：若檢測單一蛋白條帶，則只切取該蛋白條帶位置即可；若檢測多個蛋白條帶，則分別切取后合并；若檢測整個泳道蛋白，建議樣品只跑較短時間濃縮膠或分離膠即可切取檢測。
Q：用于質譜檢測的膠條樣品蛋白量要求？
A：若為單一蛋白條帶，該蛋白量不少于 20μg；若為多個蛋白條帶，各個蛋白的蛋白量不少于 20μg；若為整個泳道蛋白，蛋白總量不少于 50μg（其中含量較低的蛋白不易檢測）；若為純化后蛋白的互作蛋白條帶，建議純化前蛋白量不少于 5mg（純化前蛋白量過低，導致純化后互作蛋白含量較低，檢測蛋白數目較少）；膠條蛋白量不能依靠膠條染色的顏色深淺來判斷，因為顯色時間越長，顏色會越深。
Q：純化后蛋白可以直接使用蛋白溶液進行檢測嗎？
A：不可以，純化蛋白時通常會使用抗體（親和純化不需要），如果不進行 SDS-PAGE 分離，抗體會發生干擾；如果進行興趣蛋白的互作蛋白的研究，則必須進行SDS-PAGE從而實現將興趣蛋白排除（。興趣蛋白一般會是高豐度的表達，不排除會造成檢測干擾）
Q：蛋白膠點鑒定時，2-DE采用銀染染色的方法，是否會對后續的質譜鑒定產生影響？
銀染試劑里不要使用戊二醛，因為它會對蛋白進行修飾，這樣會影響后續的蛋白鑒定。
Q：膠條鑒定的結果中有很多蛋白，怎么確定這些蛋白的含量高低？
膠條鑒定是一種定性分析，不是定量分析。如需要知道蛋白在一個樣品中含量高低，可以根據每個蛋白的譜圖數量進行粗略估計，譜圖數越多，說明該蛋白豐度越高。如要對多個樣品的同一個蛋白的含量進行比較，則可選擇iTRAQ或者label free法進行相對定量。
Q：膠條鑒定結果中，如何挑選可信蛋白？
A:在膠條鑒定中，鑒定蛋白的標準是至少含有一個uniQue peptide，列表中都是鑒定到的蛋白，并給出相應的得分。您可根據得分，結合分子量、等電點等信息篩選目標蛋白。
Q：膠條項目，如何比較幾個樣品中共有蛋白質和特有的蛋白質？
A:可利用文氏圖進行分析比對。在地址//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html輸入protein ID即可。
Q：膠點鑒定結果與跑出的雙向蛋白圖譜比較相差較大的情況下，該如何判斷一個膠點中給出的幾個甚至十幾個點蛋白中哪個蛋白可信度最高？
A:蛋白質譜鑒定是通過肽段歸并到蛋白，因此有些鑒定到的蛋白可能是目標蛋白的同源蛋白或該蛋白的一亞基，而蛋白的人為或天然修飾、降解等情況都會影響該蛋白出現在膠圖中的位置。一般來講，Mascot鑒定得分越高，可信度就越高，其次可以結合分子量、等電點、肽段覆蓋率等信息篩選可信度高的蛋白質。
Q：如何保證蛋白的鑒定質量？
A:首先，對于肽段和譜圖匹配的離子得分（Ion Score），Mascot會給出一個鑒定閾值（Identity Score），如果離子得分（ion score）大于鑒定閾值（identity score），則為可信的肽段匹配；低于閾值的肽段匹配，是不可信的，會被過濾掉。對于不同的離子得分，Mascot會根據候選肽段段的數目和得分來確定這個閾值，所以這個閾值并不是固定的某個值。
為了保證蛋白的可信程度，還可以設置蛋白的特有肽段的個數（UniQue Peptides），即唯一對應某個蛋白的肽段。只有當蛋白含有至少1個uniQue peptide就認為被鑒定到，同時會給出得分。
Q：為什么要進行蛋白質組全譜分析？
A:蛋白質組(Proteome)指由一個物種或一個細胞、組織表達的所有蛋白質。蛋白質全譜分析目的在于鑒定樣本中盡可能多的肽和蛋白質混合物的組分。基于質譜技術的全譜分析，可為蛋白高通量的定量和修飾分析提供參考信息。
基于高精度液質聯用技術進行蛋白質全譜分析，可以對復雜樣本進行蛋白種類分析，并進行相應的生物信息分析包括蛋白質的鑒定、GO分類和代謝通路的分析等，為蛋白質組學提供有力工具。
Q：目前可進行蛋白質組全譜分析的物種有哪些？
A:只要物種在蛋白質組數據庫中存在足夠多的數據、基因組已知或 EST（或轉錄組）數據足夠豐富，均可進行蛋白質組全譜分析。對以上條件均不滿足的物種，可在進行蛋白質組全譜分析的同時，做一個基因組或轉錄組測序，以便為蛋白質組全譜分析提供支持。因此，理論上，所有的物種均可進行蛋白質組全譜分析。
Q：全譜分析中不同分析類型的優缺點？
1）SDS‐PAGE‐LC‐MS/MS分析通過電泳技術對樣品中的蛋白質進行分離，對分子量在10KDa~100KDa的蛋白質分離效果好、分辨率高。但是，對分子量小于 10KDa 和大于 100KDa的蛋白質、低豐度蛋白、極端酸堿性蛋白、疏水蛋白（如膜蛋白）的分離則存在一些難以克服的困難；
2）HPLC‐LC‐MS/MS分析通過HPLC對樣品中的蛋白質進行分離，分離效能高、靈敏度高、應用范圍廣、分析速度快，此分離方法在對酸堿性、疏水性的蛋白質分離效果優于SDS‐PAGE分離。HPLC的缺點是存在“柱外效應”，被分離物質的任何擴散和滯留都會顯著地導致色譜峰的加寬，產生假陽性。
Q：應該如何選擇全譜分析方法？
A:若待分析對象中包含內在膜蛋白等極性較強的疏水性蛋白質和分子量較大（>100KDa）或較小（<10KDa）的蛋白質時，建議采用 HPLC‐LC‐MS/MS分析法。若待分析對象不以膜蛋白等極性較強的疏水性蛋白質為主且分子量多集中于10~100KDa范圍時，建議采用SDS‐PAGE‐LC‐MS/MS分析法。
Q：全譜分析一般能鑒定到多少種蛋白？
A:這取決于分析樣品的復雜程度、數據庫完善度、蛋白含量和蛋白質組分離程度等。如植物來源的樣本中蛋白質種類和數量通常比動物來源的樣本多，動物組織樣本中蛋白質種類和數量比其血液樣本多。通常情況下，全譜分析可以鑒定到1000~3000種蛋白。
Q：蛋白鑒定的修飾分析只提供3種特定的分析嗎？是否可以鑒定磷酸化、乙酰化等其他修飾？結果中是否可以看到哪一個氨基酸發生了修飾？
A:
1）3種常規修飾：氧化，烷基化，乙酰化。
2）一般磷酸化、泛素化前期需要做富集，自然狀態下的磷酸化、乙酰化的量非常少，串聯質譜根據母離子的豐度選取 topN 進行二級碎裂來檢測，若前期不進行富集，最終鑒定到的磷酸化、乙酰化肽段可能不多。
3）多肽信息表中（peptide）包含具體哪一個氨基酸位點發生了修飾。
Q：蛋白制樣的過程當中是否加磷酸酶和蛋白酶抑制劑 cocktail？
A:需要加，加蛋白酶抑制劑防止蛋白被降解，加磷酸酶抑制劑防止磷酸化的丟失。
Q：CoIP/IP/Pulldown產物跑膠的時候用銀染還是考染？
A:兩種都可以。一般產物比較少，銀染靈敏度較高，推薦銀染。考染靈敏度低，未出現條帶處也可能鑒定到蛋白。
參考文獻：
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