一、納米微球概況

微球是直徑在納米和微米尺度范圍的球形顆粒。球形物體是自然界存在最穩定的物質形態，它是三維幾何空間理想的對稱體，也是單位體積中所有立體形態中面積最小的。納米微球作為一種功能性納米材料，由于其表面高活性，操作快捷方便、生產，已廣泛應用于生物科研、生物制藥、醫療診斷、環境檢測、食品藥品安全檢測等領域。

圖1   納米微球是未來發展的基石

二、翎因兵器譜

我司以納米微球粒徑控制、表面功能化和規模化生產為核心，致力于研發生產生物活性分子和生物分離材料，也對其中的納米微球按照古代兵器譜進行一些排序。

2.1 百兵之帥——刀——二氧化硅磁珠（硅基磁珠）

二氧化硅磁珠一般為核殼結構，由磁性內核Fe₃O₄和外層二氧化硅組成，如圖2所示。二氧化硅被認為是當今世界最為理想的包被材料，它有著良好的生物相容性及化學穩定性，能夠利用硅烷偶聯劑很容易進行表面功能基團的調控。二氧化硅磁珠克服了Fe₃O₄納米顆粒易氧化的問題，化學穩定性好，具有強磁響應性和親水性，能夠減少磁性納米顆粒間的磁偶極相互作用，且易于表面改性。因此在核酸提取、小量蛋白分離富集（如IP、Co-IP、Pull-down等）等領域普遍使用。

圖2   翎因生物二氧化硅磁珠

二氧化硅磁珠最具特色的用途是核酸純化。其原理為：由于DNA和RNA具有帶負電的磷酸鹽骨架結構，如下圖3，核酸很容易以胍或鈉正離子為橋聯離子吸附在SiO₂表面。

圖3   核酸與二氧化硅的結合

二氧化硅磁珠表面含有不同的基團和性質，均可用來提取核酸。

（1）羥基磁珠

濃度較高的鹽溶液和低pH的溶液條件下，核酸可以與SiO₂的表面結合。溶液變為低鹽高pH后，核酸脫離，以此洗脫純化，如圖4所示。磁珠提取步驟簡單，無需離心，適合大量、快速、高通量提取。同時，降低下游PCR實驗的抑制因子（多糖類、酚類），提高后續分子生物學實驗效率，減少PCR反應發生假陰性的概率。目前很多知名生物公司都利用羥基二氧化硅磁珠開發了商業化的核酸提取試劑盒。

圖4   磁珠法提取核酸示意圖

（2）羧基磁珠

高濃度NaCl和PEG溶液中，DNA與羧基磁珠的表面結合，待降低PEG和NaCl濃度，DNA就可以從羧基磁珠表面洗脫分離，這就是羧基磁珠的固相可逆化吸附。羧基磁珠對核酸的吸附作用機理還不完全明了，可能是核酸在低鹽低PEG條件下，呈現的狀態是隨機彎曲的形態，而在高鹽高PEG條件下，它會迅速成為一種較為緊密的形態。因此，我們可以理解為松散且彎曲的核酸有著較優的水溶性，很難吸附到羧基磁珠上，相反，緊密形態的核酸則能夠很好地吸附到羧基磁珠表面。

（3）氨基磁珠

氨基磁珠一方面含有SiO₂的殼層來吸附核酸，另一方面，作為陽離子表面的氨基極易和核酸結合，進行陽離子交換吸附。文獻報道，與市面上銷售的試劑盒比較，氨基磁珠開發的試劑盒回收率和吸附量都更勝一籌。而且操作過程中無需使用醇類試劑，對下游實驗影響降到最低。

（4）Oligo-dT包被磁珠

表面偶聯了寡聚dT的Oligo-dT包被磁珠可以特異性結合mRNA中的PolyA，可以應用于mRNA純化試劑盒，操作過程快速高效，實驗過程無需離心、沉淀。總RNA中提取帶有PolyA的信使RNA多用此方法。另外，對于緩沖液進行調整，可以開發與商品化試劑TRIzol相媲美的mRNA提取試劑盒以及All-in-one試劑盒。

圖5   Oligo-dT包被磁珠純化mRNA的原理示意圖

2.2 百兵之王——槍——瓊脂糖凝膠

圖6   瓊脂糖分子結構示意圖

瓊脂糖是由1,3連接的β-D-吡喃半乳糖和1,4連接的3,6脫水α-L吡喃半乳糖殘基交替連接形成的直鏈線性多糖，分子結構如圖6所示。很早以前人們就發現瓊脂糖在高溫下能夠溶于水，瓊脂糖的熱溶液經冷卻可以形成水凝膠，圖7表示瓊脂糖水凝膠形成過程的示意圖。在形成凝膠的過程中，兩條單獨的多糖鏈在氫鍵作用下先形成平行的雙螺旋，之后這些雙螺旋通過氫鍵和疏水作用聚集形成具有有序結構的纖維束，纖維束之間形成五角形的孔，一般每個五角形孔結構具有10∽10⁴個多糖纖維束。

圖7   瓊脂糖凝膠的形成過程

瓊脂糖凝膠介質是多糖類層析分離介質中應用最廣的一種。作為一種天然的多糖材料，瓊脂糖微球由于具有多孔性、親水性、不含帶電基團以及多糖鏈上的羥基在一定的條件下可以偶聯上不同的配基等優點，廣泛應用于蛋白質、復合大分子、核酸、多糖、質粒以及病毒的分離純化。瓊脂糖微球除了可以作為凝膠過濾介質外，當用不同的配基對瓊脂糖微球進行修飾后，還可以得到基于不同分離原理的介質，包括離子交換層析介質、疏水層析介質和親和層析介質等。目前層析分離中主要應用的瓊脂糖微球，如Sepharose 4FF、Sepharose 6FF以及以此為基礎偶聯不同配基所制備的一系列疏水、親和、離子交換介質等，其平均粒徑均在90μm左右，粒徑分布范圍一般在45∽165μm之間。

表1   Sepharose和Superose系列型號及性能

我司用于生物分子純化的瓊脂糖凝膠有His標簽蛋白瓊脂糖凝膠和GST標簽蛋白瓊脂糖凝膠，用于His標簽蛋白和GST標簽蛋白的純化。

圖8   His標簽蛋白和GST標簽蛋白瓊脂糖凝膠的結構

2.3 百兵之君——劍——瓊脂糖磁珠

瓊脂糖磁珠通常是以Fe₃O₄為核、瓊脂糖為殼的核/殼結構微球。它兼具了磁珠和瓊脂糖凝膠兩者的特性，一方面表面的瓊脂糖提供豐富的基團和天然的多孔結構，具有天然的分離純化效果，另一方面可以通過磁性分離來實現高通量的自動化操作。瓊脂糖磁珠通常用于蛋白/抗體純化，也可用于免疫沉淀（IP）、免疫共沉淀（Co-IP）、Pull-down等。

圖9   瓊脂糖磁珠

2.4 百兵之祖——棍——聚合物磁珠

聚合物磁珠是以Fe₃O₄為核、聚合物為殼的核/殼結構微球，主要有聚苯乙烯磁珠、聚丙烯酸磁珠、聚丙烯酰胺磁珠。該類型的磁珠與二氧化硅磁珠較為相似。不同的是，使用聚合物包裹Fe₃O₄可以制備出粒徑更小，比表面積更大的磁珠及粒徑更為均一的磁珠。但制備該類型的磁珠通常需要對表面包裹的聚合物進行改性，改性技術的好壞直接影響著磁珠的非特異性吸附的多少，因此不同廠家的磁珠質量可能會出現參差不齊的現象。聚合物磁珠主要應用于體外診斷（IVD），蛋白分離純化，細胞分離等方面。

圖10   聚苯乙烯磁珠

2.5 百兵之魁——戟——葡聚糖磁珠

葡聚糖磁珠是一種表面包覆葡聚糖的超順磁Fe₃O₄納米粒子。因葡聚糖磁珠低毒性、生物相容性，生物降解性，衍生性等特點，因此該類型的磁珠主要用于細胞分選，磁共振成像，造影劑等。磁珠分選細胞原理為：利用結合了磁珠的抗體去標記細胞，通過磁場將結合磁珠與未結合磁珠的細胞分離開來。

圖11   細胞分選磁珠——葡聚糖磁珠

三、納米微球的選配

一般而言，在日常小型分離特定蛋白質和蛋白復合物時，以及進行手動和自動化標準IP、Co-IP、ChIP、ChIP-Seq、RIP和Pull-down反應并立即用于后續檢測分析時，硅基磁珠或聚合物磁珠是最佳選擇。當抗體成本較低并且想要純化大量目的蛋白用于多種下游分析時，瓊脂糖凝膠是最佳選擇。而瓊脂糖磁珠集合了磁珠和瓊脂糖凝膠兩者的優勢，是未來生物實驗的最佳幫手。

磁珠是蛋白純化實驗中的常見工具之一，對比瓊脂糖凝膠實驗步驟更精簡，無需裝柱和過柱層析，常用于批量純化實驗中。使用瓊脂糖磁珠純化，我們可以輕松平行處理多種樣品的同時，保證產量和純度。

體外診斷試劑中使用的磁珠主要是聚苯乙烯磁珠，它的粒徑更易于控制，均一性和分散性較好，最適合IVD行業。

細胞分選磁珠主要是葡聚糖磁珠，最負盛名的是美天旎細胞分選磁珠，我司的細胞分選磁珠還在研制中，期待未來與大家的見面。

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