摘要

選擇性自噬中自噬調節蛋白在自噬底物的選擇和運輸過程中起關鍵作用，作者以自噬調節蛋白Optineunin (OPTN)為底物，通過酵母雙雜交篩選到腫瘤抑制基因 HACE1，進一步驗證含有 HECT domain 的HACE1能夠與OPTN蛋白 相互作用，促進 OPTN 的泛素化。進而發現泛素化的OPTN 能夠被p62的泛素結合結構域識別并結合，從而調節細胞內自噬活性。

亮點

本文研究中基本覆蓋了大部分涉及蛋白互作以及蛋白翻譯后修飾的研究的相關實驗，諸如內源性IP/CO-IP、外源性IP/CO-IP、GST pulldown、原核表達純化、泛素化檢測、IP/質譜、突變體應用，截斷體GST pulldown等等。既為讀者提供了具體實驗應用的方法、適用的場景，也為讀者研究蛋白修飾提供了修飾和思路。

正文

首先，作者通過免疫沉淀(IP)檢測發現在細胞中內源性OPTN被大量的泛素化修飾。值得注意的是，免疫沉淀(IP)檢測是在RIPA緩沖液中進行的，進一步證明該泛素化信號不是由于其UBAN結構域結合泛素化修飾蛋白而是OPTN 蛋白自身被泛化修飾。（見Figure 1 B及Figure S1 B）。此外，作者還分別用自噬抑制劑 BafilomycinA1 和溶酶體抑制劑 Bortezomib (BTZ) 分別處理細胞，并且檢測處理后內源性OPTN的蛋白水平變化。結果提示OPTN 通過自噬-溶酶體途徑而非泛素-蛋白酶體途徑降解。（見Figure S1 A）

基于以上結果，作者進一步以OPTN為靶蛋白通過酵母雙雜交方法篩選與其互作的相關蛋白，最后得到腫瘤抑制基因HACE1。（見Figure 1 C、Figure 1 D）

作者又利用免疫共沉淀（CO-IP）分別檢測外源性HACE1 和 OPTN、內源性HACE1 和 OPTN均在細胞內存在相互作用。（見Figure 1 E、Figure 1 F）

分別通過大腸桿菌表達系統獲得重組蛋白HACE1和 OPTN，通過GST pulldown證明HACE1 和 OPTN存在直接相互作用。此外，通過構建不同的截短體利用GST pulldown實驗證明 HACE1 通過 N 端 ankyrin repeats 與 OPTN 蛋白 C 端 411-456aa (HACE1 interaction region HIR) 直接相互作用。（見Figure 1G-J）

再通過免疫熒光實驗確認HACE1 和 OPTN在HEK293FT細胞共定位與細胞質中。（見Figure S1 C）

Figure 2. Tumor Suppressor HACE1 Ubiquitylates OPTN with Lys27and Lys48 Ubiquitin Linkages and on Multiple Lys Residues of OPTN, IncludingLys193

通過前一部分的實驗我們已驗證HACE1 和 OPTN可以特異性識別、結合，那么HACE1 是否可以促進 OPTN泛素化，如何促進OPTN泛素化，這一部分作者做了詳細探討。

首先，通過重建體外泛素化系統，在ATP、E1、E2等幫助下，HACE1 能夠催化 OPTN 蛋白泛素化。（見Figure2 A）

通過表達不同的泛素突變體(K6, K11,K27, K29, K33, K48, K63-only)，免疫沉淀（IP:OPTN ），發現OPTN 被K27和K48的泛素鏈修飾。（見Figure 2 B-C）;而HACE1 knockdown 之后、OPTN 泛素化也相應被抑制，而且OPTN 泛素化可以被 Usp2cc 特異性抑制。（見Figure S2 A-B）作者進而在自噬缺陷的細胞系 ATG7 -/- 中過表達Flag-OPTN 等相關蛋白，通過免疫沉淀（IP:Flag ）證明 K48 泛素化修飾的 OPTN 蛋白是通過自噬溶酶體途徑被降解的。（見Figure 2 D）

作者隨后通過體外泛素化反應并電泳切膠條送質譜檢測。通過分析質譜數據找到 12 個泛素化修飾的位點。（見Figure S2 C-D）

根據質譜分析結果，構建了OPTN不同的突變體通過免疫沉淀（IP ）發現 OPTN 193 位 Lys 突變為 Arg 后，與OPTN WT 相比泛素化修飾水平明顯減少，這意味著193 位Lys 位點對于 HACE1 介導的 OPTN 泛素化修飾起著至關重要的作用。（見Figure S2 E-F及Figure 2 F-G）

此前已有文獻報道：磷酸化修飾能促進自噬受體OPTN與 LC3結合介導沙門氏菌通過自噬途徑被清除。作者利用體外大腸桿菌純化GST-LC3,OPTN和 OPTNK93R，通過 GST-pulldown 實驗證明了 Lys193 位點 的突變不影響OPTN 與 LC3 的結合。（見Figure S2 G-H）

作者相繼驗證了：

1、HACE1 能夠明顯的增加 [LC3II]/[LC3 I] 的比例；

2、OPTN 蛋白能調節細胞自噬活性，自身通過自噬途徑被降解；

3、HACE1 誘導的自噬需要 OPTN 蛋白介導，HACE1 介導的OPTN 的泛素 化修飾能夠促進細胞自噬，增強細胞清除氧化蛋白的能力

由于以上相關實驗不涉及，免疫沉淀相關實驗，小編就不一一贅述。

在既有研究中作者發現， p62 的參與能促進 HACE1 和 OPTN 對自噬活性的調控，接下來作者再次利用免疫共沉淀（CO-IP）證明了，HACE1,OPTN 和 p62 蛋白會形成一個復合物。（見Figure 4 C-D）

作者再次通過免疫沉淀（IP）證明：1、過表達泛素化位點突變的OPTNK193R后，HACE1, OPTN 和 p62 互作明顯降低；2、過表達全長的 p62 能夠與HACE1 和泛素化 修飾的 OPTN 有相互作用。（見Figure 5 A-B）

3、p62只能與被HACE1泛素化修飾的OPTN相互作用，而且泛素化修飾的 OPTN也只能與p62全長相互作用。（見Figure 5 C-D）

4、HACE1介導的OPTN的K48的泛素鏈修飾能夠與p62有相互作用，而非K27的泛素鏈修飾。（見Figure 5 E-G）

       最后，作者分別通過克隆形成、裸鼠成瘤、免疫組化等相關實驗，在組織、動物模型等分別對之前結論加以驗證。

由于以上相關實驗不涉及，免疫沉淀相關實驗，小編就不一一贅述。

A model depicting how the HACE1-OPTNaxis might suppress tumor through promoting autophagy in vivo

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